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考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量的正確使用方法!

更新時(shí)間:2021-09-07      瀏覽次數(shù):7706

考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量的正確使用方法!

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分析。


在酸性溶液中,考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物;該復(fù)合物在595nm處有最大吸收峰, 其顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。該方法靈敏度高,適合微量蛋白質(zhì)分析。

使用所需設(shè)備:

產(chǎn)品組成:

試劑一:液體×1瓶,4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1瓶,4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提?。?/span>

液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。

組織樣品:準(zhǔn)確稱取約0.1 g樣品,加1mL提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水),冰浴勻漿,10000rpm,4℃離心10min,取上清,即待測液。(動(dòng)物樣品常常需要稀釋)

吸光值測定:

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取0.5mL EP管,加入40μL蒸餾水,250μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,記為A空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取0.5mL EP管,加入40μL標(biāo)準(zhǔn)液,250μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測定管:取0.5mL EP管,加入40μL待測液,250μL試劑一,混勻后室溫靜置10min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于595nm比色,10~20min完成比色,記為A測定管。

蛋白質(zhì)含量計(jì)算公式:

C待測(µg/m L)= C標(biāo)準(zhǔn)管×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

                =50×(A測定管-A空白管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)品蛋白質(zhì)濃度,50μg/mL。

注意事項(xiàng):

1.加考馬斯亮藍(lán)后,在10~20min內(nèi)吸光值相對較穩(wěn)定,因此須在10~20min完成比色。

2.不宜用石英比色皿,可用玻璃或塑料比色皿,測完成后立即用95%乙醇沖洗。

3.測定前用1~2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),確保蛋白濃度在0~100µg/ml范圍內(nèi),否則需要做相應(yīng)稀釋。







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