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NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF的正確操作!

更新時間:2021-11-02      瀏覽次數(shù):1618

NI-NTA瓊脂糖凝膠6FF的正確操作!

Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標簽重組蛋白的一種純化介質,它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得.它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達系統(tǒng)表達的6×His標簽重組蛋白。NTA,含有四個螯合區(qū),較一般的三齒螯合劑能更好的結合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合,從而使His標簽蛋白結合在Ni-NTA純化介質上,未結合的蛋白被洗滌下去,結合在介質上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來,從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質與His標簽蛋白具有*的親和力,可達5-20mg/ml??稍诜亲冃院妥冃詶l件下純化任何表達系統(tǒng)所得的His標簽蛋白。純化程序簡單,所得的蛋白純度可高達95%。Ni-NTA可再生4-6次,重復使用。

Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預先偶聯(lián)Ni2+離子。通常,Ni2+是用于純化重組組氨酸標簽蛋白的優(yōu)選金屬離子,用咪唑進行洗脫。我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液,中性至弱堿性pH 7-8,這樣的條件下結合,經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl,但是在金屬-蛋白質親和非常弱的情況下應該避免,因為它可以降低結合強度,在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。如果重組組氨酸標簽蛋白表達為包涵體,則在所有緩沖液中包括高達6M Gua-HCl或8M尿素。當使用高濃度的尿素或Gua-HCl時,通常發(fā)生蛋白質解折疊。包涵體變性復性是個很復雜的過程,一般的建議純化可溶蛋白。

注意事項:

1.上樣之,樣品必須經(jīng)過膜過濾及去除色素,否則雜質及色素會被吸附到填料上,影響填料的正常使用。

2.在使用過程中,避免使用高濃度的強酸強堿,酸和堿的濃度應低于 0.1 摩爾。堿會使流速變慢。

3.不同的樣品,吸附和洗脫方法不相同,可以根據(jù)相關的文獻進行。



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